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核酸疫苗免疫机制及优化

时间:2015-11-05 13:02来源:华派生物 作者:admin 点击:
核酸疫苗是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒载体作为疫苗,以使机体产生针对该抗原的保护免疫应答。1990年Wolff等给小鼠肌肉注射纯化的DNA或RNA重组表达载体,发现载体上的基因能在局部肌肉细胞表达,并可持续数月,甚至持续终生,且没有检测出注射的外源核酸与宿主染色体整合。1991年william等发现输入的外源基因在体内的表达产物可诱导免疫应答。1993年Ulmer等直接给小鼠肌肉注射含有编码甲型流感病毒核蛋白的重组质粒DNA,可有效保护小鼠抗不同亚型、分离时间相隔34年的流感病毒的攻击。1994年世界卫生组织(WHO)将其正式统一命名为核酸疫苗(nucleic acid vaccine)。

核酸疫苗具有许多潜在的优势,它的诞生给基因治疗和免疫学领域带来了不可估量的前景,开创了疫苗学研究的新纪元。它由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成,包括DNA疫苗和RNA疫苗,目前研究较多的是DNA疫苗。DNA疫苗为含有编码抗原基因的真核表达质粒DNA,接种机体后,被体细胞摄取,并转录、翻译、表达出相应的抗原,然后通过不同途径刺激机体产生针对此种抗原的细胞免疫及体液免疫应答。目前,核酸疫苗已在病毒性疾病。细菌性疾病、寄生虫免疫、抗肿瘤免疫、预防变态反应中发挥了巨大的作用。

1 核酸疫苗诱导免疫应答的机制

核酸疫苗接种后,质粒DNA进入细胞核,利用胞内的RNA聚合酶启动转录,产成的mRNA在胞浆中与游离的核糖体结合,翻译表达成内源性抗原蛋白。其中一部分结合到泛肽上,呈递到蛋白酶,降解为多肽,通过抗原肽转运结构运送到内质网腔,与MHC I类分子形成聚合体,再进入高尔基体,最终递呈于细胞膜表面,诱发CD8+细胞毒性T细胞的免疫应答。另一部分蛋白抗原从分泌它们的抗原递呈细胞的细胞膜上进入MHC II类型途径,抗原蛋白在溶酶体中水解,产生约20~25个氨基酸的多肽,该溶酶体和含有MHC II类分子的囊泡融合,多肽 与MHC II类分子结合形成MHC异聚体被呈递到细胞膜表面,与CD4+T细胞反应,使其分泌细胞因子,促进B细胞介导的体液免疫应答。而有一部分抗原多肽被直接递呈给B细胞,使B细胞活化,产生特异性抗体,诱发体液免疫应答。另外,递呈后的CD4+限制性T细胞(Th)被活化增殖可产生多种细胞因子,进一步促进和强化体液免疫和细胞免疫。

2 核酸疫苗研制的技术路线

2.1 目的基因的获得
目的基因是核酸疫苗中编码保护性抗原的序列,它是诱导宿主产生免疫保护反应的抗原物质,它是诱导机体产生针对某种病原的特异性免疫应答的前提。通常用PCR或RT-PCR法扩增目的基因,最好使用高保真酶进行扩增以避免引入突变造成蛋白质编码错误。

         2.2 真核质粒表达载体的选择

         核酸疫苗是通过将质粒DNA导入细胞中表达成抗原蛋白而诱导免疫反应,因此须将目的基因克隆连接入真核表达载体中。目前常用的真核表达载体多以pBR322或pUC19质粒及其衍生质粒为基本骨架,其带有细菌复制起始点,能在大肠埃希氏菌内高效稳定地复制,但不能在哺乳动物细胞内复制。启动子是细胞核内RNA聚合酶的识别区域,表达载体上的启动子如猴空泡病毒SV40早期启动子、劳氏瘤病毒启动子RSV、腺病毒主要晚期启动子ADV和人巨细胞病毒CMV早期启动子。另外在载体上还必须有增强子序列,以增强启动子的转录能力。不同的启动子在不同细胞中转录水平有所不同,而同一段抗原基因在不同启动子的调控下表达量的多少也有差异,而其表达量的高低直接影响核酸疫苗的免疫效果,因此须经试验对不同的启动子进行筛选。

         2.3 目的基因与表达载体相连及阳性重组子筛选

         根据真核表达载体上的多克隆位点(含有数个限制性内切酶),用引物在目的基因两端加上酶切位点,再与载体进行酶切连接,构成重组子。引入酶切位点时要避免发生阅读框的移码。利用载体上的抗生素抗性和PCR测序进行阳性重组子的筛选。

         2.4大肠杆菌发酵

         细菌发酵是生产质粒DNA的第一步,也是决定质粒DNA量的关键。培养基中的成分主要为碳源、氮源和矿物质、培养基的优化方法有多种,如单因素法、正交设计试验法及响应面分析法。吴昊利用响应面优化发酵培养基使质粒容积产量比普通LB培养基提高了近1倍。碳氮对质粒产量的影响进行了研究,优化培养基成分为:酪蛋白胨10.42g/L、蔗糖9.96g/L、NaCl 10g/L、酵母粉5g/L、(NH4)2SO4 6.4g/L、甘油9.8g/L,该培养基发酵细菌产生的质粒量为普通LB的03.5倍。

         在工程菌培养过程中,一般适当降低生长速率有利于增加质粒拷贝数和超螺旋含量百分数。其一是因为生长速率的减小给质粒在菌体中复制提供了足够的时间;其二是生长速率过快,菌体产生的乙酸堆积会抑制质粒的复制。控制适当的生长速率的方式有:1、通过限制碳源浓度来控制生长速率;2、针对葡萄糖代谢易形成乙酸的缺点,采用非发酵型碳源——甘油;3、适当降低温度来降低生长速率。

         溶解氧浓度及pH值也是影响高密度发酵的重要因素。

         2.5质粒提取与纯化

         裂解质粒的方式很多,如超声波法、匀浆法等,但在规模化制备中,碱裂解法应用最为广泛,加入碱液时应轻轻搅拌均匀以避免局部过碱,因为pH大于12.5会导致质粒DNA不可逆变形;搅拌能使细胞完全裂解,但不能过于激烈,否则会使质粒被机械剪切而开环比例增加。如何纯化质粒以除去裂解菌体后产生的RNA、宿主DNA和内毒素有如下几种方法:离子交换色谱法、凝胶过柱法、反向亲和色谱法。

         2.6超螺旋质粒的评判

         提取的质粒有3种存在形式:超螺旋质粒、闭合环状质粒及线状质粒。大量数据表明超螺旋质粒的转染效率及转染后的体内表达效果最好,以超螺旋质粒含量占90%以上为质粒质量的判断标准。以分光光度计测定质粒的纯度(260nm/280nm)及质粒的浓度,以琼脂糖凝胶电泳判断超螺旋质粒的比例。

 另外质粒的储存液及浓度对质粒的稳定性、靶细胞的转染效率等均有影响。以往多将质粒DNA溶解于154mmol/LNaCl中,Hartikkal等的实验结果表明,质粒储存在150mmol/L的磷酸钠中可增加质粒DNA在体内表达2-7倍。

         2.7转染哺乳动物细胞及表达抗原蛋白检测

         在使用核酸疫苗免疫动物前必须确保抗原蛋白的正确表达,因此需将质粒DNA转染细胞以便检测。转染的方法有磷酸钙共沉降法、电穿孔法及脂质体转染法,转染一定时间后收集细胞,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot检测抗原蛋白质的表达。若无相应的抗体也可选用RT-PCR检测抗原mRNA的表达。

         2.8 质粒DNA免疫动物

         验证抗原蛋白能正确表达后,将质粒DNA免疫动物,常用肌肉注射免疫,免疫2至3次,检测出血清抗体及CD4+/CD8+T细胞比例以分析免疫应答效果,研究阶段时还需进行攻毒实验,以验证疫苗的保护效果。

         3 核酸疫苗优化

         核酸疫苗依赖抗原蛋白的表达来诱发机体免疫应答,因此抗原表达量的高低直接影响免疫应答水平,另外佐剂的使用、免疫途径和剂量等因素都对核酸疫苗的使用效果有影响。如何提高核酸疫苗的免疫应答水平一直是研究者们关注的热点。

         3.1目的基因选择

         目的基因选择是否准确决定了核酸疫苗的免疫保护效果。因此需选择编码主要保护性抗原或其抗原表位的基因作为目的基因。而对于易变异的病毒(如流感病毒),则可以选择各亚型所共有的核心蛋白保守序列作为抗原基因,这样构建的疫苗可以产生跨株系的免疫保护反应,避免易变异病毒产生的免疫逃避问题。另外将几个具有免疫保护功能的抗原基因串联构架核酸疫苗或联合免疫接种,也可收到较好的免疫保护效果。

         3.2真核表达载体的优化

         真核表达载体表达抗原蛋白的能力强弱直接关系到其诱导宿主产生免疫应答的能力,因此,选择合适的启动子与增强子系统对核酸疫苗蛋白的表达水平至关重要。可利用较强的启动子、提高启动子的效率、优化密码子、甲基化碱基等方式改造载体骨架或通过添加合适的免疫刺激序列(ISS)来优化真核表达质粒。ISS可充当免疫佐剂的作用,提高免疫应答能力,使机体获得更快、更有效、更持久的免疫应答。目前,关于免疫刺激序列的研究主要集中在CpG序列上,CpG序列由胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤为基原组成,它与Toll 9 相互作用,可以激活多种免疫细胞,诱导其分泌不同的细胞因子及免疫球蛋白,在激发非特异性免疫应答、增强抗原特异性免疫应答及调控免疫应答类型(Th1及Th2型)起重要作用。研究发现CpG的免疫刺激作用还有明显的种属特异性,应根据免疫动物的类型选择合适的CpG和重复次数,以提高核酸疫苗的免疫效应。

         3.3 免疫佐剂的优化

         佐剂是一种预先或与抗原同时注入体内,可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强物,对于疫苗免疫应答的产生和增强具有重要作用。除常规的佐剂外,以细胞因子、趋化因子和协同刺激分子、补体分子以及其他一些共刺激分子作为佐剂是当前研究的热门,它们都有较好的增强免疫的效果并且无刺激无残留。可将编码这些佐剂的基因单独构建于质粒中,便于不同剂量和时间给药;也可以与抗原基因构建与同一质粒中,以降低生产成本,简化实验操作。不同的佐剂偏向诱导的免疫应答类型有不同,如细胞因子IFN-ɑ、IL-2、IL-12倾向诱导Th1型的免疫反应而IL-4、IL-5、IL-6等则倾向诱导Th2型的免疫反应。因此可将几种佐剂联合使用,以诱导更全面的免疫应答。

         3.4 免疫途径的优化

         不同的免疫途径和免疫方式可对抗原DNA的吸收、表达和呈递产生影响,从而诱导出不同强度的免疫反应。常用的免疫途径主要为肌肉、静脉、腹腔、皮内和皮下等直接注射,在对比研究后发现,经肌肉注射获得的免疫保护力要优于其它几种方式。常规免疫途径虽操作简单,无需复杂设备,但需要较大的接种剂量。因此为了提高质粒DNA进入细胞的效率也随之诞生了一些新的接种技术,如穿电孔、纳米粒、基因枪等。基因枪法是将质粒DNA附着于高速金颗粒上,直接射入细胞组织内,具有一枪发射多处击中、没有污染的特点,但对于较脆弱的组织器官易造成损伤,且深部组织较难射入,设备昂贵,目前尚不具备普遍使用的可行性。电穿孔法是以注射部位为中心点释放电脉冲,改变局部组织细胞膜的通透性,细胞膜表面产生微小的通道,这种通道能维持几毫秒到几秒,DNA质粒由此进入细胞,随后通道自行恢复。电穿孔法转染效率显著高于常规注射法,对导入的靶器官和核酸片段大小没有限制,操作简单快速,对核酸的用量也较少,是目前较热门的一种接种方式。另一方面研究者们发现直接接种裸DNA的效果有时不尽人意,可能是DNA被细胞摄取的量较少,还易受到组织液中的核酸酶攻击。因此选择使用一些物质将质粒DNA包裹起来再接种,如脂质体、细菌菌脱等。脂质体是带正电荷的聚合物,能包裹带负电荷的核酸,再与细胞膜融合,使核酸进入细胞。它是核酸疫苗的良好载体,还能明显增强核酸疫苗的免疫应答,体液中干扰素和白介素的水平也明显升高(即Th1/2细胞的反应性增强—),但它的作用会受到包封率、溶血磷脂的氧化融合作用以及使用剂量等因素的局限。细菌菌脱是革兰氏阴性菌被噬菌体裂解基因E裂解后剩下的细菌完整空壳,不仅能包裹DNA还具有增强免疫的佐剂功效。核酸疫苗的接种方式直接影响质粒DNA进入细胞的效率,从而影响抗原蛋白的表达量,应根据不同的抗原和宿主类型选择最佳接种方式,并综合考虑转染效率,接种部位抗原提呈细胞的抗原提呈能力,方便性及有效性,是否对组织产生刺激、毒性等因素。

         3.5 免疫剂量的优化

         为保证抗原基因的持续表达需要摸索核酸疫苗的接种剂量和次数。一般来说,对小鼠最适宜的质粒DNA接种剂量为50~100ug,兔子为500ug,并且一次免疫就能产生较好的免疫应答;而对大型动物(如牛、,马、猪等)因细胞间隙大,结缔组织丰富,则需要毫克级质粒DNA才能引发明显的免疫反应,并且需多次免疫,以保证抗原蛋白的表达水平。

         展望

         核酸疫苗较传统疫苗相比具有不可比拟的优势,已在免疫学及预防医学等方面显示出巨大潜能,人用核酸疫苗方面迄今已有10余种被美国FDA批准进入非临床和临床试验。畜禽用病毒核酸疫苗的研发也逐渐加快步伐,但多数还处于实验室阶段。而如何提高抗原在体内的表达水平、使用何种佐剂辅助激活免疫应答、采用何种免疫方式及质粒递送途径能增强体内细胞对质粒DNA的吸收、免疫的次数及剂量、生产工艺的突破等等都是今后影响核酸疫苗真正走向市场所面临的重要问题。虽然仍有不少的难题需要攻克,但不久的将来核酸疫苗将对人类疾病的防治及畜牧业的持续健康发展起到划时代的作用。


(责任编辑:admin)
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